Massimo Ambrosini lahir pada tanggal 29 Mei 1977 di Pesaro, Italia. Pemain berkebangsaan Italia ini menempati posisi sebagai pemain tengah. Dia terkenal dengan kemampuan tackling-nya.

Ambrosini memulai karirnya di Liga Italia Serie B bersama Cesena dan masuk dalam tim intinya pada usia 17 tahun selama musim 1994–95. Pelatih AC Milan, Fabio Capello, akhirnya memenangkan pertarungan untuk dapat membelinya di musim 1995-1996 dan Ambrosini berhasil turut andil mempersembahkan Scudetto bagi klubnya. Pada musim 1996–97, dia dipinjamkan ke Vicenza dan sukses membuat klub itu bisa bertahan di Serie A. Pada tahun 1999 dia kembali ke Milan dan berhasil menjadi pemain inti.

Ambrosini menjadi kapten Milan saat absennya Paolo Maldini di musim 2007-2008. Pada musim 2008-2009, dia juga berhasil menjadi pemain inti.

Ambrosini membuat debut internasional pertamanya bersama tim nasional Italia pada bulan April 1999 melawan Kroasia.